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近日，厦门大学崔勇教授团队联合香港中文大学姜里文教授团队在Advanced Science发表题为Structural and Functional Characterization of EXPO-Derived Extracellular Vesicles in Plants的研究论文，该研究系统解析了植物 EXPO 来源胞外囊泡的结构特征与生物学功能，为深入理解植物胞外囊泡的形成与作用机制提供了重要理论框架，并揭示了 EXPO 胞外囊泡在植物防御反应中可能发挥的关键作用。

在真核生物中，蛋白质向胞外的转运主要通过两种外泌途径完成，即传统蛋白质分泌途径和非传统蛋白质分泌途径。通常，含有 N 端信号肽或跨膜结构域的蛋白质经由传统分泌途径，依次进入内质网和高尔基体，并通过反式高尔基体网络（TGN）被分选，最终分泌至细胞外或定位于细胞质膜。然而，近年来的研究发现，许多分泌蛋白同时缺乏 N 端信号肽和跨膜结构域，提示真核细胞中广泛存在非经典（非传统）分泌途径。不同于依赖内质网—高尔基体体系的传统分泌方式，非传统分泌途径负责将不含信号肽的蛋白质以及其他细胞成分直接输送至细胞外空间。其中，一条重要的非传统分泌通路是通过细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）介导蛋白质、RNA 和脂质等多种分子的跨膜转运。EVs是由细胞释放至细胞外空间的膜性纳米囊泡，EV 介导的分泌过程广泛存在于几乎所有真核细胞中。在哺乳动物和酵母体系中，已充分表征的细胞外囊泡主要包括三种类型：① 外泌体（exosomes），即多囊泡体（multivesicular bodies，MVBs）与质膜融合后释放的腔内囊泡（intraluminal vesicles，ILVs）；② 微囊泡（microvesicles），由质膜特定区域向外出芽形成；以及③ 凋亡小体（apoptotic bodies），由程序性细胞死亡过程中产生的细胞碎片组成。由于植物细胞具有坚硬的细胞壁结构，可能对囊泡的释放、运输及功能发挥形成物理限制，长期以来植物细胞中外泌体的存在及其生物学功能尚未得到充分认识。尽管如此，近几十年来不断积累的研究证据表明，植物细胞同样能够分泌具有明确生物学功能的细胞外囊泡。

鉴于以往研究在技术手段上的局限性，本研究直接采用三维电子断层扫描（electron tomography，ET）技术开展分析。该技术不仅能够精确测量囊泡的尺寸及其腔内成分，还可提供完整的三维结构信息，从而判定胞间隙中的囊泡是否已完全脱离质膜——这一特征被认为是鉴定真实植物外泌体的关键判据。通过对拟南芥根细胞进行三维电子断层扫描分析（图1），我们发现胞间隙中存在多种类型的细胞外囊泡：其一为直径约 50–200 nm，腔内缺乏明显内容物的小型 EVs；其二为直径约 200–500 nm，腔内富含核糖体、在结构上与 EXPO 双层膜特征相似的中型 EVs；其三为直径约 500–2000 nm，形态不规则且腔内同时含有核糖体和微小囊泡的大型 EVs。此外，这些不同类型的 EVs 不仅存在于拟南芥根组织中，在叶片和下胚轴中同样可以观察到。

图1. 基于三维电子断层扫描技术对拟南芥根细胞中不同类型细胞外囊泡的结构特征鉴定。

为排除高压冷冻过程中试剂处理和时间因素对细胞外囊泡形态可能产生的影响，研究进一步采用冷冻电子断层扫描（cryo-electron tomography，Cryo-ET）技术，在近天然状态下捕捉 EVs 的超微结构特征。以花粉管和花粉粒为研究对象，分别采用室温电子断层扫描（RT-ET）和 Cryo-ET 两种技术进行对照分析。在 Cryo-ET 实验中，花粉管样品通过浸没冷冻法快速固定，随后结合冷冻聚焦离子束（cryo-FIB）铣削技术进行薄片制备；而对于厚度超过 20 μm 的花粉粒样品，则采用新近建立的SOLIST技术（serial on-lamella in situ lift-out tomography），通过提升取出法从高压冷冻载体中分离并提取局部样本，以便进行后续的 cryo-FIB 研磨和冷冻电子断层扫描成像。结果显示，在两种 ET 技术条件下观察到的 EVs 在形态和结构特征上高度一致，表明室温 ET 方法能够有效保存胞外囊泡及相关胞外管状结构的真实形态（图2）。

图2. 利用（冷冻）电子断层扫描技术研究拟南芥发育花粉管和花粉粒中的细胞外囊泡

电子断层扫描数据揭示了植物细胞中存在多种具有不同形态特征的细胞外囊泡群体。然而，仅依赖形态学特征对 EV 进行分类仍存在明显局限，其生物发生来源及分泌机制亦尚不清楚。目前已报道的植物 EV 标记蛋白主要包括 TETRASPANIN 8（TET8）、PENETRATION 1（PEN1，又称 SYP121）以及 Exo70E2。为明确这些标记蛋白是否对应不同的 EV 亚群，我们进一步结合免疫金标记透射电子显微镜分析，对 Exo70E2、TET8 和 PEN1 的定位进行了系统比较（图3）。结果显示，约 76% 的中型 EVs 表现为 Exo70E2 阳性，而 TET8 则主要标记直径为 50–200 nm 的小型 EVs，其中 87% 为阳性（n = 33）。相比之下，PEN1 主要定位于根细胞中的大型 EVs 以及花粉粒胞外的管状结构中。值得注意的是，部分 PEN1 阳性的大型 EV 仍与质膜保持连续连接，提示其可能来源于质膜出芽过程。综合上述结果表明，拟南芥中至少存在三类具有不同标记特征和生物发生途径的 EV 群体。

图3. 免疫金标记透射电子显微镜分析显示，由 Exo70E2、TET8 或 PEN1 标记的细胞外囊泡亚群呈现出各自独特的结构特征。

为进一步探究 EXPO 衍生细胞外囊泡的独特功能，研究人员采用免疫分离策略，在拟南芥悬浮细胞中表达 Exo70E2-GFP。通过消化细胞壁获得原生质体后，破裂细胞膜并进行不连续密度梯度的亚细胞分级，从而对 EXPO 衍生囊泡所携带的货物蛋白进行系统表征。鉴于已有研究表明 Exo70E2 在植物细胞中对 EXPO 的形成及其向胞外运输至关重要，研究进一步聚焦于 Exo70E2/EXPO 通路在细胞生理过程中的潜在功能，选取 exo70e2-2 和 exo70e2-3 突变体开展功能分析（图4）。在正常生长条件下，exo70e2-2、exo70e2-3 突变体以及 Exo70E2-GFP 过表达材料均表现出轻度的生长迟缓表型。进一步的转录组测序分析及病原体抗性检测结果显示，EXPO 来源的细胞外囊泡参与植物防御反应，可能通过在病原体侵染过程中递送防御相关蛋白发挥作用。上述结果共同构建了理解植物细胞外囊泡异质性及其功能分工的研究框架，并揭示 EXPO 衍生的细胞外囊泡可能构成植物防御体系中的关键组成部分。

图4. EXPO 衍生的细胞外囊泡在植物抵抗病原体感染过程中发挥着关键作用。

综上所述，本研究综合运用三维电子断层扫描、冷冻电子断层扫描、光电关联显微技术以及免疫金标记透射电镜，对不同植物物种及多种细胞类型中的细胞外囊泡进行了系统研究。基于囊泡的尺寸、腔内成分及分子标记特征，我们对正常生理条件下植物 EV 群体进行了系统表征，并将其划分为三类。上述发现共同构建了理解植物细胞外囊泡异质性的研究框架，并进一步揭示 EXPO 来源的细胞外囊泡可能构成植物防御体系中的关键组成部分。

厦门大学崔勇教授和香港中文大学姜里文教授为本论文的共同通讯作者。香港中文大学高嘉阳博士、厦门大学博士后李彦斌、厦门大学博士生张晟奇、香港中文大学何艺林博士为本论文共同第一作者，香港中文大学刘智琦博士、香港中文大学王涓博士、香港浸会大学花静敏博士、厦门大学已毕业硕士生陈锦宇、厦门大学博士生钟君如、香港浸会大学钟欢博士、香港浸会大学夏亦荠教授参与了本项工作。该研究得到了国家自然科学基金、福建省自然科学基金和香港研究资助局基金等项目的支持。

全文链接：http://doi.org/10.1002/advs.202506163

（图/文 崔勇团队）